اندو نوكلئازهاي محدود كننده گروهي از DNase ها ميباشند كه توالي نوكلئو تيدي خاصي را شناسايي ميكنند . اين آنزيم ها dsDNA را بصورت اختصاصي يا غير اختصاصي برش ميدهند. اين آنزيم ها اولين بار در دهه 1950 به عنوان سيستم هاي Resriction وModification ( باكتريها براي جلوگيري از حمله باكتريوفاژها و عناصر ژنتيك خارجي اين سيستم ها را بكار مي برند ) كشف شدند. باكتريها توسط سيستم R-M ميتوانند DNA اي را كه از خارج هنگام عفونت ،كنژو گاسيون و ترانسفكشن وارد آنها ميشود را تخريب كنند.سيستم R - M باكتريايي معادل سيستم ايمني پروكاريوتي ميباشد.
سيستم هاي R-M كه در ميكرو ارگانيسمها ( باكتريها ) يافت ميشوند بسيار گوناگون ميباشند (حتي در داخل يك سلول ) . تعداد اين آنزيمها از 2100 فراتر رفته و 17 آنزيم نوع I ، 179 آنزيم نوع II و 4 آنزيم از نوع III وهمچنين مشخصات 190 متيل ترانسفراز تغيير دهند DNA تعيين و شناسايي شده است .
سيستم هايR-M دو فعاليت آنزيمي دارند:
الف ) يك اندونوكلئاز (R.ENase) با جايگاه اختصاصي كه مسئول هضم DNA خارجي ميباشد
ب) يك متيلاز تغيير دهنده DNA ( متيل ترانسفراز ) كه همان توالي ويژه را شناسايي ميكند . متيل ترانسفراز ( M.MTase) مسئول تغيير دادن وحفظDNA خودي از هضم شدن توسط R.ENase ميباشد. ممكن است فعاليت R وM در يك آنزيم (واحد) كه داراي چند زير واحد است قرار داشته و يا از نظر فيزيكي آنزيم هاي جداگانه باشند. علي رغم اينكه آنزيم هاي Restriction و Cognate Modifications سكانس مشابه را شناسايي ميكنند، ترادف اسيد آمينه آنها يكسان نيست، شايد اين آنزيم ها با مكانيسم متفاوت DNA هدف را شناسايي ميكنند .
انواع سيستم هاي آنزيمي Restriction - Modification
بر اساس تركيب آنزيم ، كوفاكتورهاي مورد نياز ، قرينگي توالي DNA اي كه شناسايي ميكنند و مشخصات هضم DNA به چهار نوع تقسيم ميشوند. لازم به ذكر است كه گروه متيل دهنده سوبسترا در تمام متيل ترانسفرازها AdoMet ميباشد.
آنزيم هاي R-M نوع I:
مجموعه چند آنزيمي متشكل از زير واحد هاي غير همسان بنام R,M و S ميباشند. زير واحد S اختصاصيت را براي MوR تعيين ميكند. كوفاكتور هاي اين آنزيمها ATP وMg2+ ميباشند و DNA اي كه تغييري در آن ايجاد نشده باشد را در محلي دور از جايگاه شناسايي و تا اندازه اي بصورت احتمالي ( Random ) برش ميدهند . هيدرو ليز ATP قسمتي از فعاليت Restriction اين آنزيم ها ميباشد و بطريق رقابتي با فعاليت اندون.كلئازي خودش جايگاه اختصاصي DNA هدف را متيله ميكنند.
آنزيم هاي R-m نوع II :
اين آنزيمها داراي فعاليت R.ENase و M.MTase جداگانه ميباشند . R.ENase ها دايمر بوده و زير واحد هاي آنها همسان است در صورتيكه M.MTase ها آنزيم هاي مونومر ميباشند . R.ENase هاي نوع II براي فعاليت خود فقط Mg2+ نياز دارند.
R.ENase ها و M.MTase ها تواليهاي اختصاصي نوكلئوتيدي مشابه را شناسايي ميكنند . اكثر R.ENase هاي نوع دوم DNA را ازمحل جايگاه شناسايي برش ميدهند ولي تعدادكمي از آنها كه نوع IIS گفته ميشوند DNA را در فاصله معيني از جايگاه شناسايي برش ميدهند .
آنزيم هاي R-M نوع III:
اين آنزيم ها متشكل از دو زير واحد غير همسان ميباشند كه براي فعاليت رستريكشن به ATPو Mg2+ نياز دارند. اين آنزيم هاتوالي هاي كوتاه غير پاليندرم را شناسايي كرده و DNA را از محلهاي معين (درصورتيكه درجايگاه شناسايي تغييري ايجادنشده باشد )برش ميدهند اين آنزيمها ATP را هيدروليز نميكنند و براي برش دادن DNA به AdoMet ( S-adenosylmethionine)نياز ندارند اما AdoMet موجب تحريك فعاليت اندو نوكلئازي آنهاميشود.
آنزيم هاي نوع IV :
اين آنزيمها از نظر تكاملي بين آنزيم هاي نوع IIوIII ميباشند. اين آنزيمها (مانند Eco571) متشكل از R.ENae و M.MTase جدا گانه ميباشند اما R.ENase كه يك آنزيم مونومر ميباشد فعاليت متيلازهم دارد. اين فعاليت متيلازي قدرت كافي ندارد تا DNA ميزبان را در In vivo محافظت كند.R.ENase و M.MTase توالي هاي ناقرينه را شناسايي ميكنند . R.ENase در حضور Mg2+ در فاصله معيني از جايگاه شناسايي, DNA هدف را برش ميدهد ( مثلا" Eco571 بفاصله 14/16 نوكلئو تيد از محل شناسايي اين كار را انجام ميدهد ) . فعاليت Restriction آنها توسط AdoMet تحريك ميشود.
سيستم هاي Modification يا Restriction مستقل
علاوه بر چهار سيستم آنزيمي كه بحث شد ، بعضي از باكتريها سيستم هاي ديگري مانند سيستم R مستقل از M و سيستم M مستقل از R دارند. يك مقوله اي از سيستم هاي R-M كه در تكنولوژي نو تركيب اهميت بخصوصي دارد Restriction وابسته به Methylation ) MDRS) ميباشد كه R.ENase ترجيحا" DNA را در جايگاههاي متيله برش ميدهد . MDRS متشكل از فرآورده هاي ژني است كه به چندين جايگاه مستقل در ژنوم E.coli K12 مانند mcrA , mcrB و mrr متصل ميباشند.
سيستم هاي آنزيمي R-M نوع II:
آنزيم هاي محدودكننده ، مخصوصا" نوع II توالي نوكلئو تيدي منحصر بفرد را شناسايي ميكنند. دقت در انتخاب توالي نوكلئو تيدي خاص ، تنوع توا لي جايگاه شناسايي و آساني نسبي كنترل Restriction با استفاده از M.MTase ، آنزيم هاي نوع II را وسيله اي ضروري براي دستكاري DNA نموده است . بعلاوه توسعه DNA نوتركيب نتيجه كشف آنزيم هاي با جايگاه اختصاصي ميباشد.
تا كنون ژن حدودصدسيستم R-M كلون شده وتعيين مشخصات شده اند. ژن سيستم هاي R-M از نظر سازمان، Orientation و اندازه هتروژن هستند . كلونينگ ژنهاي آنها خالص سازي آنزيم را آسان تر كرده و آنزيم با خلوص بالاتر تهيه ميشود . بنا بر اين با قيمت كمتر براي استفاده وسيع تر در دسترس قرار دارند . اين كشف موجب شد تا جزئيات مكانيسم واكنش و بر خورد DNA -protein در سطح مولكولي مطالعه شود. اغلب R.ENase ها بصورت تجارتي در دسترس قرار دارند و براي ايجاد قطعات DNA براي كلون كردن ژن ، تعيين نقشه DNA و كروموزوم ، DNA Sequencing و هيبريداسيون بطور گسترده استفاده ميشودارند.
نامگذاري آنزيمهاي R-M
1- سه حرف اول ( ايتاليك ) جنس ( اولين حرف جنس باكتري ) و گونه ( دومين و سومين حرف ) ارگانيسم منبع را بيان ميكند. مانند Eco براي E.coli و Hin براي هموفيلوس آنفلوآنزا .
2- بعد از سه حرف مذكور حرف اول سويه يا گونه بصورت غير ايتاليك و يا اعداد عربي مي آيد مانند: EcoK بري Ecoli سويه K ، Hind براي H.influenza سويه d يا Sau 3A براي استافيلوكوك اورئوس 3A . عناصر خارج كروموزومي مانند ويروس يا پلاسميد به همين صورت متعاقب اسم مذكور آورده ميشود مانند: EcoRI و EcoPI.
3- متعاقب آن بدون در نظر گرفتن فاصله ، اعداد روماني (I,II,III,.....) براي تعيين آنزيم هاي مختلف كه توسط همان سويه توليد ميشوند مانند HindII و HindIII .
4- براي اختصاصي كردن R.ENase يا M.MTase حروف بزرگ R و M در جلو نشانه آنزيم قرار ميگيرد و با يك نقطه از آن فاصله ميگيرد مانند : R.EcoRI و M.EcoRI.
منبع:http://www.iranbiotech.com